The importance of flow cytometry in the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / A importância da citometria de fluxo no diagnóstico e monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna

ABSTRACT Introduction: The paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is an acquired clonal disease of the hematopoietic stem cells, and it is clinically characterized by chronic intravascular hemolysis, bone marrow failure and hypercoagulability leading to thrombosis. It is a rare disorder of the hematopoietic stem cells that occurs due to a somatic mutation in the gene phosphatidylinositol glycan class A (PIG-A). Objective: Here we reviewed the importance of screening and monitoring of individuals with high risk of developing PNH, since the early diagnosis of the disease is essential for better prognostic and treatment choice for the patient. Method: A review was carried out with great focus on the pathophysiology and diagnosis of PNH, mainly with the use of flow cytometry technique to detect the disease. Results: This gene codifies an enzyme essential to the formation of glycosylphosphatidylinositol (GPI), which acts as a molecular anchor for many membrane proteins. The alteration of GPI synthesis promotes a partial or complete loss of proteins that needs this molecular anchor to bind to the cell surface. Among these proteins are the CD55 and the CD59, which control the activation of the complement cascade. Conclusion: The immunophenotyping exam with flow cytometry is considered the reference test for PNH diagnosis, since the technique is highly sensitive and specific, presenting advantages as the quantitative identification of small populations of cells with PNH phenotype and the capacity to distinguish cells with partial or total deficiency of GPI-anchored proteins.

RESUMEN Introducción: La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad clonal adquirida de células madre hematopoyéticas; se caracteriza clínicamente por hemólisis intravascular crónica, insuficiencia medular e hipercoagulabilidad, que conduce a trombosis. Es un trastorno raro de las células madre hematopoyéticas que ocurre debido a una mutación somática en el gen fosfatidilinositol-glicano de clase A (PIG-A). Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo revisar la importancia del cribado y seguimiento de individuos con alto riesgo de desarrollar HPN, pues el diagnóstico precoz de la enfermedad es vital para un mejor pronóstico y la elección del tratamiento del paciente. Métodos: Se realizó una revisión con mayor enfoque en la fisiopatología y diagnóstico de la HPN. El foco principal de la investigación fue el uso de la técnica de citometría de flujo para detectar la enfermedad. Resultados: Ese gen codifica una enzima esencial en la formación de glicosilfosfatidil inositol (GPI), que actúa como molécula de anclaje para varias proteínas de membrana en las células hematopoyéticas. Cambiar la síntesis de GPI genera una pérdida parcial o total de proteínas que necesitan esta molécula de anclaje para unirse a la superficie celular. Entre esas proteínas se encuentran CD55 y CD59 presentes en los eritrocitos, que controlan la activación de la cascada del complemento. Conclusión: La técnica de inmunofenotipificación por citometría de flujo se considera la prueba de referencia para el diagnóstico de HPN, ya que es altamente sensible y específica, presenta ventajas como la identificación cuantitativa de pequeñas poblaciones de células con el fenotipo de HPN y la capacidad de distinguir células con deficiencia parcial o total de proteínas ancladas por GPI.

RESUMO Introdução: A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma enfermidade clonal adquirida de células-tronco hematopoiéticas; caracteriza-se clinicamente por hemólise intravascular crônica, falência medular e hipercoagulabilidade, levando a tromboses. É uma rara desordem das células-tronco hematopoiéticas que ocorre devido a uma mutação somática no gene fosfatidilinositol glicano classe A (PIG-A). Objetivo: Este trabalho teve como objetivo revisar a importância do rastreamento e monitoramento de indivíduos com alto risco de desenvolvimento da HPN, pois o diagnóstico precoce da doença é essencial para um melhor prognóstico e a escolha do tratamento para o paciente. Metodologia: Foi realizada uma revisão com mais enfoque na fisiopatologia e no diagnóstico da HPN. O foco principal da pesquisa foi o uso da técnica da citometria de fluxo para a detecção da doença. Resultados: Esse gene codifica uma enzima essencial na formação de glicosilfosfatidil inositol (GPI), a qual atua como molécula âncora de diversas proteínas de membrana nas células hematopoiéticas. A alteração da síntese de GPI gera uma perda parcial ou completa de proteínas que necessitam dessa molécula-âncora para se ligarem à superfície celular. Entre estas proteínas estão o CD55 e o CD59 presente em eritrócitos, que controlam a ativação da cascata do complemento. Conclusão: O exame de imunofenotipagem por citometria de fluxo é considerado o teste de referência para diagnóstico de HPN, pois a técnica é altamente sensível e específica, apresentando vantagens como a identificação quantitativa de pequenas populações de células com fenótipo HPN e a capacidade de distinguir células com deficiência parcial ou total de proteínas ancoradas pela GPI.

Estudo Pioneiro sobre a Presença de Clone de Hemoglobinúria Paroxística Noturna durante Acompanhamento Terapêutico de Leucemia Aguda / Pioneering Study about the Presence of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Clone during Therapeutic Monitoring of Acute Leukemia / Estudio Pionero sobre la Presencia de un Clon de Hemoglobinuria Paroxística Nocturna durante el Seguimiento Terapéutico de la Leucemia Aguda

Introdução: O potencial de transformação maligna de células-tronco hematopoiéticas portadoras de mutações no gene glicosilfostatidilinositolclasse A (PIG-A) para leucemias agudas, embora raro, já é bem descrito na literatura. Objetivo: Neste estudo, porém, buscou-se evidenciar pela primeira vez na literatura o surgimento ou a manutenção de clones de hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) em pacientes diagnosticados com leucemia aguda ou ainda após o início do tratamento quimioterápico. Método: A pesquisa de clones de HPN foi realizada por citometria de fluxo em blastos, hemácias, granulócitos ou monócitos de 47 amostras de sangue periférico e medula óssea de pacientes submetidos à investigação diagnóstica ou acompanhamento terapêutico, provenientes de dois hospitais oncológicos e públicos de Belém, no período de dezembro de 2017 a dezembro de 2018. Resultados: A presença de clones de HPN foi observada em 19/47 (40,4%) amostras de pacientes, em investigação diagnóstica ou acompanhamento terapêutico, que realizaram pelo menos um estudo de acompanhamento terapêutico e ainda tiveram o surgimento ou a manutenção do clone de HPN mesmo após iniciado o tratamento quimioterápico. Conclusão: Foi possível evidenciar, de forma primária, a presença de clones de HPN em pacientes diagnosticados com leucemia aguda tanto no período de investigação diagnóstica como durante o acompanhamento terapêutico, independentemente da ontogenia celular. Sem, porém, que se possa ainda avaliar a importância da presença desses clones de HPN para a evolução da doença primária, prognóstico ou necessidade de tratamento específico.

Introduction: The potential for malignant transformation of hematopoietic stem cells carrying mutations in theglycosylphosphatidylinositol class A (PIG-A) gene for acute leukemias, although rare, is already well described in the literature. Objective: In this study, however, it was attempted to show for the first time in the literature the emergence or maintenance of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) clones in patients diagnosed with acute leukemia or even after the beginning of the chemotherapy treatment. Method: The search of PNH clones was performed by flow cytometry in blasts, erythrocytes, granulocytes or monocytes of 47 samples of peripheral blood and bone marrow from patients undergoing diagnostic investigation or therapeutic follow-up in two oncological and public hospitals in Belém, from December 2017 to December 2018. Results: The presence of PNH clones was observed in 19/47 (40.4%) patient samples, in diagnostic investigation or therapeutic follow-up, who participated of at least one therapeutic follow-up study and still experience the appearance or maintenance of the PNH clone even after the beginning of the chemotherapy treatment. Conclusion: Primarily, it was possible to demonstrate the presence of PNH clones in patients diagnosed with acute leukemia both during the diagnostic investigation period and therapeutic follow-up, regardless of cell ontogeny. However, the importance of the presence of these PNH clones for the evolution of the primary disease, prognosis or need for specific treatment was not evaluated yet.

Introducción: El potencial de transformación maligna de las células madre hematopoyéticas que portan mutaciones en el gen glicosofosfatidilinositol (GPI) clase A (PIGA) para las leucemias agudas, aunque raro, ya está bien descrito en la literatura. Objetivo: En este estudio, sin embargo, buscamos mostrar por primera vez en la literatura la aparición o mantenimiento de clones de HPN en pacientes diagnosticados de leucemia aguda o incluso después del inicio de la quimioterapia. Método: La investigación de clones de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) se realizó mediante citometría de flujo en blastos, eritrocitos, granulocitos o monocitos de 47 muestras de sangre periférica y médula ósea de pacientes sometidos a investigación diagnóstica o seguimiento terapéutico de dos hospitales oncológicos y públicos de Belém, durante el período. de diciembre de 2017 a diciembre de 2018. Resultados: La presencia de clones HPN se observó en 19/47 (40,4%) muestras de pacientes, en investigación diagnóstica o seguimiento terapéutico, que realizaron al menos un estudio de seguimiento terapéutico y aún tenían la aparición o mantenimiento del clon HPN incluso después de iniciado el tratamiento de quimioterapia. Conclusión: Se pudo evidenciar, de forma primaria, la presencia de clones de HPN en pacientes diagnosticados de leucemia aguda tanto durante el período de investigación diagnóstica como durante el seguimiento terapéutico, independientemente de la ontogenia celular. Sin embargo, no podemos todavía evaluar la importancia de la presencia de estos clones de HPN para la evolución de la enfermedad primaria, el pronóstico o la necesidad de un tratamiento específico.

Current global scenario of guidelines on the management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: a systematic literature review / Cenário global de diretrizes para o manejo da hemoglobinúria paroxística noturna: uma revisão sistemática da literatura

Objective: To report the outcomes of a systematic literature review of guidelines and consensus on the management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and describe the main therapeutic options available worldwide. Methods: A systematic literature review was conducted in April 2018 with no time limit and reported in line with the PRISMA statement. The AGREE II instrument was used to determine the quality of each guideline included in the systematic review. Results: Eight guidelines/consensus were eligible, one developed by an international group, two in Spain, and one each in Turkey, Germany, Argentina, Australia and the United Kingdom. Supportive treatment with erythrocyte transfusion, anticoagulants and steroids is indicated by all guidelines and consensus. The use of erythropoietin is suggested by three of them. Recommendations for the prescription of eculizumab were consistent in all but one guideline, published in 2005. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is reported as the only potentially curative treatment for PNH, although its association with high mortality and morbidity rates is emphasized, being indicated for a selected group of patients. The AGREE II scores applied for each domain showed in general a low and heterogeneous methodological quality among guidelines. Conclusion: Despite the low and heterogeneous methodological quality, in general the comparison of guidelines and consensus for PNH management showed consistent recommendations regarding supportive care, eculizumab and hematopoietic stem cell transplantation.

Objetivo: Relatar os desfechos de uma revisão sistemática da literatura de diretrizes e documentos de consenso sobre o manejo da hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) e descrever as principais opções terapêuticas disponíveis mundialmente. Métodos: Uma revisão sistemática da literatura foi conduzida em abril de 2018 sem limite temporal e realizada de acordo com a recomendação PRISMA. O instrumento AGREE II foi utilizado para determinar a qualidade de cada diretriz incluída na revisão. Resultados: Foram elegíveis oito diretrizes/consensos, um desenvolvido por um grupo internacional, dois na Espanha e um em cada um dos países a seguir: Turquia, Alemanha, Argentina, Austrália e Reino Unido. O tratamento de suporte com transfusão de eritrócitos, anticoagulantes e esteroides é indicado por todos os documentos. A eritropoetina é indicada por três deles. A recomendação de prescrição do eculizumabe foi consistente em todos, exceto em um publicado em 2005. O transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas é reportado como o único tratamento com potencial curativo para a HPN, apesar de uma enfática associação com maiores taxas de mortalidade e morbidade, sendo indicado para grupos selecionados de pacientes. Os escores AGREE II aplicados para cada domínio demonstraram, em geral, qualidade metodológica baixa e heterogênea entre as diretrizes. Conclusão: Apesar da qualidade metodológica baixa e heterogênea, em geral, a comparação de diretrizes e consensos para o manejo da HPN demonstrou recomendações consistentes quanto ao uso de tratamento de suporte, eculizumabe e transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

The case of eculizumab: litigation and purchases by the Brazilian Ministry of Health / O caso do eculizumabe: judicialização e compras pelo Ministério da Saúde

ABSTRACT OBJECTIVES This study examined the purchases of eculizumab, a high-cost monoclonal antibody used in the treatment of rare diseases by Brazilian federal agencies, in terms of purchased quantities, expenditures, and prices. METHODS Eculizumab purchases made between March 2007 and December 2018 were analyzed, using secondary data extracted from the Federal Government Purchasing System (SIASG in Portuguese). The following aspects were assessed: number of purchases, purchased quantities, number of daily doses defined per 1,000 inhabitants per year, annual expenditures, and prices. The prices were adjusted by the National Broad Consumer Price Index for December 2018. Linear regression was used for trend analysis. RESULTS All acquisitions by federal agencies were made by the Brazilian Ministry of Health. The purchases began in 2009 with tender waiver to comply with legal demand. There was an increasing trend in the number of purchases and quantities acquired over time. Two hundred and eighty-three purchases were made, totaling 116,792 units purchased, 28.2% of them in 2018. The adjusted total expenses summed more than R$ 2.44 billion. After market approval by the Brazilian Health Regulatory Agency, the weighted average price fell approximately 35%, to values under the Medicines Market Chamber of Regulation established prices. CONCLUSION Eculizumab represented extremely significant expenditures for the Brazilian Ministry of Health during the period. All purchases were made to meet demands from lawsuits, outside the competitive environment. The market approval of eculizumab promoted an important price reduction. This study indicates the relevance of licensing and the need for permanent monitoring and auditing of drug purchases to meet legal demands.

RESUMO OBJETIVOS O estudo examinou as aquisições de eculizumabe, um anticorpo monoclonal de alto custo utilizado no tratamento de doenças raras, pelos órgãos federais brasileiros, em termos das quantidades compradas, gastos e preços. MÉTODOS Foram analisadas compras de eculizumabe realizadas entre março de 2007 e dezembro de 2018, por meio de dados secundários extraídos do sistema de compras do governo federal (Siasg). Foram examinados o número de compras, quantidades adquiridas, número de doses diárias definidas por 1.000 habitantes por ano, gastos anuais e preços praticados. Os preços foram corrigidos pelo índice nacional de preços ao consumidor amplo para dezembro de 2018. Regressão linear foi utilizada para análises de tendência. RESULTADOS Todas as aquisições por órgãos federais foram realizadas pelo Ministério da Saúde. As compras se iniciaram em 2009, sendo efetuadas por dispensa de licitação e para atendimento de demanda judicial. Houve tendência crescente no número de compras e quantidades adquiridas ao longo do tempo. Foram realizadas 283 compras, totalizando 116.792 unidades adquiridas, 28,2% compradas em 2018. Os gastos totais contratados corrigidos somaram mais de R$ 2,44 bilhões. Após a aprovação do registro pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária, o preço médio ponderado caiu aproximadamente 35%, para valores abaixo dos preços estabelecidos pela Câmara de Regulação do Mercado de Medicamentos. CONCLUSÃO O eculizumabe representou gastos extremamente significativos para o Ministério da Saúde no período. Todas as compras foram feitas para atendimento de demandas judiciais, fora do ambiente competitivo. Seu registro promoveu queda importante nos preços praticados. O estudo aponta a relevância do registro sanitário e da necessidade de monitoramento e auditoria permanentes das compras de medicamentos para atendimento de demandas judiciais.

Hemoglobinuria paroxística nocturna y absceso hepático: asociación poco frecuente / Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and hepatic abscess: A little frequent association

Resumen: La hemoglobinuria paroxística nocturna es un trastorno adquirido de las células madre hematopoyéticas que se caracteriza por episodios de hemólisis intravascular. Aunque es una enfermedad poco frecuente, afecta en su mayor parte a adultos jóvenes, sin distinción de sexo. Comunicamos el caso de un paciente de 32 años de edad, que acudió a consulta con cuadro clínico de palidez, ictericia, hemoglobinuria y dolor en el hipocondrio derecho. El estudio de citometría de flujo de médula ósea reportó la ausencia de marcadores CD55 y CD59, indicativos del diagnóstico de hemoglobinuria paroxística nocturna, además de una imagen tomográfica hipodensa en el hígado compatible con absceso. En la bibliografía médica éste es el primer caso en el que se describe la coexistencia de estas dos afecciones.

Abstract: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is an acquired disorder of hematopoietic stem cells characterized by episodes of intravascular hemolysis. Although it is a rare disease, it mostly affects young adults, regardless of sex. We present the case of a 32-year-old man with acute symptoms of paleness, jaundice, hemoglobinuria and pain in the right hypochondrium. The study of flow cytometry of bone marrow reported the absence of CD55 and CD59 markers, diagnostic indicators of nocturnal paroxysmal hemoglobinuria in addition to a hypodense tomographic image in the liver compatible with abscess. In the medical literature, this is the first case in which the coexistence of these two medical conditions is described.

Hemoglobinuria paroxística nocturna: revisión de la literatura / Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: literature Review

La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad clonal y adquirida causada por una mutación somática en el gen PIG-A que se encuentra en el cromosoma X y codifica una proteína involucrada en la síntesis del glicosilfosfatidilinositol (GPI), el cual le sirve como anclaje a muchas proteínas de la membrana celular produciendo mayor sensibilidad al complemento. Los distintos signos y síntomas que se presentan tienen gran impacto en la calidad de vida de los pacientes, por lo que un diagnóstico correcto es de vital importancia. Actualmente, la citometría de flujo multiparamétrica es la metodología de elección para detectar y seguir al paciente con HPN.

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a clonal and acquired disease caused by a somatic mutation in the PIG-A gene found on the X chromosome and encoding a protein involved in the synthesis of glycosylphosphatidylinositol (GPI), which serves as anchoring to many proteins of the cell membrane producing greater sensitivity to complement. The different signs and symptoms that appear have a great impact on the quality of life of patients, so a correct diagnosis is of vital importance. Currently, multiparameter flow cytometry is the methodology of choice to detect and follow the patient with PNH.

Diagnóstico por citometría de flujo de la hemoglobinuria paroxística nocturna / Diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria by flow cytometry

Introducción: La hemoglobinuria paroxística (HPN) nocturna es una enfermedad clonal, adquirida y no maligna de la célula madre hematopoyética. En este padecimiento se encuentra afectado el anclaje a la membrana celular de moléculas como el CD55 y CD59, fundamentales en la regulación de la lisis mediada por el complemento. Por su elevada especificidad y sensibilidad, la citometría de flujo multiparamétrica (CFM) es el método de elección para el diagnóstico de esta enfermedad. Objetivo: Establecer un algoritmo diagnóstico de la HPN por CMF. Métodos: Se analizó una muestra de sangre periférica para CFM de un paciente con sospecha de HPN. El inmunofenotipaje celular se realizó con un panel de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antígenos que se expresan en la membrana citoplasmática mediante su anclaje al glicosilfosfatidilinositol. Las muestras se leyeron en un citómetro GALLIOS, Beckman Coulter y los datos obtenidos se analizaron con el empleo del programa informático Kaluza. Resultados: Se identificaron cuatro clones HPN. En los granulocitos se observó un clon HPN de aproximadamente 90 por ciento, con deficiencia en la expresión de CD16, CD24, CD55 y CD59. En los monocitos se observaron dos clones: (1) clon CD14_CD59_ y (2) clon CD14_CD59+ con tamaños clonales de 59,77 por ciento y 19,45 por ciento, respectivamente. En los eritrocitos se identificó un clon de 19,98 por ciento y de determinó el grado de afectación. Conclusiones: El algoritmo de análisis propuesto permite identificar las poblaciones celulares con clones HPN. Además, dichos clones pueden ser cuantificados en cuanto a tamaño clonal y expresividad de los antígenos dependientes de anclaje a glicosilfosfatidilinositol. Con la CFM se logra determinar con elevada sensibilidad el grado de afectación de los eritrocitos en la expresión de CD59 como medida directa de la susceptibilidad que experimentan a la lisis por el complemento(AU)

Introduction: The paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a clonal, acquired disease and not malignant hematopoietic stem cell. In this condition, the anchor to the cell membrane of molecules such as the CD55 and CD59 is affected, This antigens are fundamental in the regulation of the complement-mediated lysis. By its high specificity and sensitivity multiparametric flow cytometry (MFC) is the goal standard for the diagnosis of this disease. Objective: To establish a diagnosis of PNH by MFC algorithm. Methods: A sample of peripheral blood of a patient with suspicion of PNH was analyzed by MFC. The cell immunophenotyping was carried out using a panel of monoclonal antibodies directed against antigens that are expressed in the cytoplasmic membrane through its the glycosylphosphatidylinositol anchor. The samples were read in a Cytometer GALLIOS, Beckman Coulter and the data obtained were analyzed with the use of the Kaluza software. Results: We identified four clones HPN. A HPN clone of approximately 90 percent, was observed in granulocytes with deficiency in the expression of CD16, CD24, CD55, CD59. In the monocytes were two clones: (1) CD14-CD59- clone and (2) CD14-CD59 + clone, with size clone of 59.77 percent and 19.45 percent, respectively. A clone of 19.98 percent was identified in erythrocytes and determined the degree of involvement of the same. Conclusions: The proposed analysis algorithm allows to identify cellular populations with clones PNH. In addition, these clones can be quantified in terms of size clonal and expressiveness of anchor to glycosylphosphatidylinositol antigen dependent. With the MFC is achieved with high sensitivity to determine the degree of involvement of the erythrocytes in the expression of CD59 as a direct measure of susceptibility undergoing lysis by complement(AU)

Renal involvement in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: a brief review of the literature

SUMMARY INTRODUCTION: Paroxysmal Nocturnal Haemoglobinuria (PNH) is an acquired genetic disorder characterized by complement-mediated haemolysis, thrombosis and variable cytopenias. Renal involvement may occur and causes significant morbidity to these patients. OBJECTIVE: To review the literature about pathophysiology and provide recommendations on diagnosis and management of renal involvement in PNH. METHODS: Online research in the Medline database with compilation of the most relevant 26 studies found. RESULTS: PNH may present with acute kidney injury caused by massive haemolysis, which is usually very severe. In the chronic setting, PNH may develop insidious decline in renal function caused by tubular deposits of hemosiderin, renal micro-infarcts and interstitial fibrosis. Although hematopoietic stem cell transplantation remains the only curative treatment for PNH, the drug Eculizumab, a humanized anti-C5 monoclonal antibody is capable of improving renal function, among other outcomes, by inhibiting C5 cleavage with the subsequent inhibition of the terminal complement pathway which would ultimately give rise to the assembly of the membrane attack complex. CONCLUSION: There is a lack of information in literature regarding renal involvement in PNH, albeit it is possible to state that the pathophysiological mechanisms of acute and chronic impairment differ. Despite not being a curative therapy, Eculizumab is able to ease kidney lesions in these patients.

RESUMO INTRODUÇÃO: A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença genética adquirida, caracterizada por hemólise mediada pelo sistema complemento, eventos trombóticos e citopenias variáveis. Envolvimento renal pode ocorrer, contribuindo com morbidade significativa nesses pacientes. OBJETIVO: Realização de revisão de literatura sobre o envolvimento renal na HPN. MÉTODOS: Pesquisa on-line na base de dados Medline, com compilação e análise dos 26 estudos encontrados de maior relevância. RESULTADOS: A HPN pode se apresentar com insuficiência renal aguda induzida por hemólise maciça, que geralmente tem apresentação grave. Em quadros crônicos, declínio insidioso da função renal pode ocorrer por depósitos tubulares de hemossiderina, microinfartos renais e fibrose intersticial. Apesar de o transplante de células-tronco hematopoiéticas permanecer como a única terapia curativa para a HPN, a droga Eculizumab é capaz de melhorar a função renal, entre outros desfechos, por meio da inibição de C5 e a subsequente ativação da cascata do complemento, que culminaria com a formação do complexo de ataque à membrana. CONCLUSÃO: Há poucas informações na literatura no que concerne ao envolvimento renal na HPN, apesar de ser possível estabelecer que os mecanismos fisiopatológicos das lesões agudas e crônicas são distintos. Apesar de não ser uma terapia curativa, Eculizumab é capaz de amenizar o comprometimento renal nesses pacientes.

Hemoglobinuria paroxística nocturna. el rol de la anhidrasa carbónica-i urinaria en la hemólisis intravascular / Peroxysmal nocturnal hemoglobinuria: the role of urinary carbonic anhydrase-I in intravascular haemolysis

La Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) se caracteriza por hemólisis intravascular crónica mediada por complemento. Cuando se produce la hemolisis se libera a circulación Anhidrasa Carbónica- I (AC-I), una enzima que se halla en alta concentración en el eritrocito y por su bajo peso molecular filtra por el glomérulo. El objetivo del presente trabajo fue detectar la excreción de la AC-I en orina de pacientes con HPN por Electroforesis Bidimensional de Utilidad Clínica (2D UC), y compararla con otras causas de hemólisis, de origen renal y postrenal. Se evaluaron 8 pacientes con HPN sin tratamiento con eculizumab un inhibidor del C5 del complemento, y 5 de ellos postratamiento, 12 orinas de pacientes con nefritis lúpica y 10 orinas de pacientes con hemólisis postrenal. La AC-I puede estar presente en la orina, en los tres grupos, sin embargo la relación AC-I/Hemoglobina en la hemólisis intravascular está invertida en comparación con la hemolisis glomerular y post-renal. Los pacientes con HPN tratados con eculizumab no presentan AC-I, y sería de utilidad en el seguimiento de los pacientes tratados con el inhibidor del C5, para evidenciar posibles escapes hemolíticos.

Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) is characterized by chronic complement mediated haemolysis. In these conditions it might be expected that carbonic anhydrase-I (AC-I) would be liberated into the plasma and excreted in the urine, by its high concentration in the erythrocyte and low molecular weight. The objective of the present study was to detect the urinary excretion of AC-I from patients with PNH by wodimensional clinical utility electrophoresis (2D UC) and to compare it with other causes of renal and post-renal haemolysis. We evaluated 8 patients with PNH without eculizumab, a complement C5 inhibitor, 5 of them posttreatment, 12 urine of patients with lupus nephritis and 10 urine of patients with post-renal hemolysis. AC-I may be present in the urine, in all three groups, however, the AC-I/Haemoglobin ratio in intravascular haemolysis is reversed compared to glomerular and post-renal haemolysis. Patients with PNH treated with eculizumab do not have AC-I and would be useful in monitoring patients treated with the C5 inhibitor to evidence possible haemolytic leaks.

Hemoglobinuria paroxística nocturna / Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria

ResumenLa hemoglobinuria paroxística nocturna es una anemia hemolítica crónica, adquirida, poco común, que afecta con igual frecuencia ambos sexos. Se manifiesta a cualquier edad y con mayor incidencia en países del sudeste asiático. Es el resultado de la expansión clonal no maligna de células progenitoras hematopoyéticas. Se caracteriza por anemia hemolítica intravascular, tendencia a la trombosis y un componente variable de insuficiencia medular.Se asocia a otras patologías hematológicas como anemia aplásica y síndrome mielodisplásico. La citometría de flujo es el método de elección para diagnóstico. El eculizumab y el trasplante de médula ósea alogénico son las únicas terapias efectivas.

Abstract:Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is a rare acquired chronic hemolytic anemia, which affects both sexes with equal frequency. It occurs at any age and more frequently in Southeast Asian countries. It is the result of non malignant clonal expansion of hematopoietic progenitor cells. It is characterized by intravascular hemolytic anemia, recurrent thrombosis and a variable component of bone marrow failure. It is associated with other hematologic disorders such as aplastic anemia and myelodysplastic syndrome. Flow cytometry is the method of choice for diagnosis. Eculizumab and allogeneic bone marrow transplantation is the only effective therapies.

Report of a case of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) with complex evolution and liver transplant / Relato de um caso de hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) com evolução complexa e transplante hepático

ABSTRACT The paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a rare acquired disease, with thrombotic episodes and frequent pancytopenia. We report the case of a 32 year-old female PNH patient with bone marrow aplasia, which followed a complex course, diagnosed with aplastic anemia associated with PNH, evolving in three years with Budd-Chiari syndrome and liver transplantation. Post-transplant complications, hepatic arterial thrombosis, graft rejection, liver retransplantation and treatment of PNH with eculizumab. Clinical stabilization and cessation of symptoms were achieved.

RESUMO Hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença rara, adquirida, com episódios trombóticos e pancitopenia frequente. Relatamos o caso de uma paciente jovem, 32 anos, sexo feminino, portadora de HPN e aplasia de medula, com evolução complexa e diagnóstico de anemia aplástica associada à HPN, evoluindo em três anos com síndrome de Budd-Chiari e transplante hepático. Complicação pós-transplante, trombose arterial hepática, rejeição do enxerto, retransplante hepático e tratamento da HPN com eculizumab. Obtiveram-se estabilização clínica e cessação dos sintomas.

Technical advances in flow cytometry-based diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / Avanços técnicos no diagnóstico e no monitoramento de hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo

ABSTRACT Objective: To discuss the implementation of technical advances in laboratory diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria for validation of high-sensitivity flow cytometry protocols. Methods: A retrospective study based on analysis of laboratory data from 745 patient samples submitted to flow cytometry for diagnosis and/or monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Results: Implementation of technical advances reduced test costs and improved flow cytometry resolution for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clone detection. Conclusion: High-sensitivity flow cytometry allowed more sensitive determination of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clone type and size, particularly in samples with small clones.

RESUMO Objetivo: Discutir as melhorias técnicas no diagnóstico e no acompanhamento laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna para a validação da técnica de citometria de fluxo de alta sensibilidade. Métodos: Estudo retrospectivo, que envolveu a análise de dados laboratoriais de 745 pacientes com hipótese diagnóstica e/ou acompanhamento de hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo. Resultados: Os avanços técnicos não só reduziram o custo do ensaio, mas também melhoraram a identificação e a resolução da citometria de fluxo para a detecção de clone hemoglobinúria paroxística noturna. Conclusão: A citometria de fluxo de alta sensibilidade possibilitou a identificação do tipo e do tamanho de clone de hemoglobinúria paroxística noturna, especialmente em amostras com pequeno clone.

Detecção de células com fenótipo HPN por citometria de fluxo, utilizando análise multiparamétrica / Detection of PNH cells by flow cytometry, using multiparameter analysis

Introduction: The laboratory diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), disease that is categorized by reduced synthesis of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor, is based on the detection of blood cells deficient in GPI-anchored proteins by flow cytometry. PNH clones have been detected in patients with aplastic anaemia (AA) and myelodysplastic syndrome (MDS), with therapeutic implications. Objectives: To validate a sensitive assay for detection of GPI-anchored protein-deficient cells, by flow cytometry, and to analyze the clone frequency in AA and MDS patients. Methods: Samples from 20 AA patients, 30 MDS patients and 20 adult volunteers (control group) were analyzed using monoclonal antibodies to CD16, CD24, CD55 and CD59 (neutrophils); CD14 and CD55 (monocytes); CD55 and CD59 (erythrocytes); besides fluorescent aerolysin reagent (FLAER) (neutrophils and monocytes) and lineage markers. The proportions of PNH cells detected in neutrophils and monocytes, using different reagent combinations, were compared by analysis of variance (ANOVA) and Pearson's correlation. Results: PNH cells were detected in five (25%) AA patients, and the proportions of PNH cells varied from 0.14% to 94.84% of the analyzed events. PNH cells were not detected in the MDS patients. However, by the analysis of these samples, it was possible to identify the technical challenges caused by the presence of immature and dysplastic circulating cells. FLAER showed clear distinction of GPI-deficient cells. Conclusion: Multiparameter flow cytometry analysis offers high sensitivity and accuracy in the detection of subclinical PNH clones. FLAER shows excellent performance in detection of PNH neutrophils and monocytes...

Introdução: O diagnóstico laboratorial da hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), doença caracterizada por deficiência de síntese da molécula de ancoragem glicosilfosfatidilinositol (GPI), baseia-se na detecção de células sanguíneas deficientes em proteínas ancoradas ao GPI, por citometria de fluxo. Clones de células com fenótipo HPN podem ser detectados em pacientes com anemia aplásica (AA) e síndrome mielodisplásica (SMD), com implicações terapêuticas. Objetivos: Validar técnica sensível para detecção de células HPN, por citometria de fluxo, e avaliar a frequência dos clones em pacientes com AA e SMD. Métodos: Amostras de 20 pacientes com AA, 30 pacientes com SMD e 20 voluntários (controles) foram analisadas, utilizando anticorpos monoclonais anti-CD16, CD24, CD55 e CD59 (neutrófilos); CD14 e CD55 (monócitos); e CD55 e CD59 (hemácias); além do reagente de aerolisina fluorescente (FLAER) (neutrófilos e monócitos) e marcadores de linhagem celular. A comparação do tamanho dos clones HPN detectados em neutrófilos e monócitos, pelas diferentes combinações de reagentes, foi realizada por análise de variância (ANOVA) e correlação de Pearson. Resultados: Em cinco (25%) pacientes com AA foram identificadas células HPN, em proporções entre 0,14% e 94,84% dos eventos analisados. O clone não foi detectado nos pacientes com SMD. Contudo, a análise dessas amostras permitiu evidenciar as dificuldades técnicas secundárias à presença de células imaturas e displásicas circulantes. O reagente FLAER propiciou separação precisa das células alteradas. Conclusão: A análise multiparamétrica por citometria de fluxo apresenta sensibilidade...

Hemoglobinuria paroxística nocturna: de Strübing al Eculizumab / Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: from Strübing to Eculizumab

La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es un trastorno clonal severo y raro no maligno y adquirido de la célula madre hematopoyética. Es el único trastorno hemolítico adquirido causado por una anomalía de la membrana eritrocitaria como resultado de una mutación somática clonal de un gen, el fosfatidilinositol glucano clase A (PIG-A) situado en el brazo corto del cromosoma X. Se han identificado una serie de proteínas reguladoras del complemento, entre las que se destacan: el factor acelerador de la degradación (CD55) y el factor inhibidor de la lisis reactiva de la membrana (CD 59) deficientes en esta enfermedad. La HPN se clasifica en clásica, asociada a otro trastorno medular y en subclínica. Su diagnóstico se apoya en estudios hematológicos, bioquímicos, pruebas serológicas especiales, estudios eritroferrocinéticos e imagenológicos. La electroforesis de proteínas de membrana de alta resolución y la citometría de flujo multiparamétrica constituyen técnicas de elección para el diagnóstico. El tratamiento de la anemia, de los episodios trombóticos y de las infecciones constituyen los pilares terapéuticos básicos. Dentro de los agentes farmacológicos más utilizados se destacan: los esteroides. los andrógenos, la eritropoyetina recombinante humana y el factor estimulador de colonias granulocíticas. Recientemente, el anticuerpo monoclonal eculizumab ha aumentado la expectativa de vida de estos pacientes con una mejoría de su calidad de vida

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a non malignant and acquired clonal disease of the hematopoietic stem cell. It is a severe and rare disease. It is the only acquired hemolytic disturbance that is caused for an erythrocyte membrane anomaly. It is a result of a somatic clonal mutation of one gene that is located in the short arm of X chromosome called phosphatidyl inositol glycan class A (PIG-A). Regulated complement proteins are identified: the decay accelerated factor (CD55) and the membrane inhibitor or reactive lysis (CD 59); the abnormal blood cells of PNH have deficiency of these two proteins. PNH is classified in: classic PNH, PNH associated with another bone marrow disturbance and PNH sub clinic. Diagnosis is obtained by hematological, biochemical, kinetics and imagenologics studies and serologic special tests. High resolution membrane protein electrophoresis and flow cytometry are the elective tests. Treatments for anemia, thrombotic episodes and infections are important in the management of these patients. Steroids, androgens, human recombinant erythropoietin and granulocytic colony stimulating factor (CSF-G) are the more used pharmacology agents. Recently, the monoclonal antibody eculizumab has increased the life expectation in these patients with a better quality of life

Transformación leucémica del clon Marchiafava Micheli. Informe de caso / Leukemic transformation of the Marchiafava Micheli clone. Inform of a case

La hemoglobinuria paroxística nocturna, también conocida como síndrome de Marchiafava-Micheli, es una enfermedad clonal y adquirida, causada por una mutación somática en el gen PIG-A que se encuentra en el cromosoma X y codifica una proteína involucrada en la síntesis del glicosilfosfatidilinositol, el cual le sirve como anclaje a muchas proteínas de la membrana celular; es la única anemia hemolítica adquirida por defecto de la membrana del eritrocito. Se caracteriza por una anemia hemolítica crónica intravascular, hemoglobinuria, hipercoagulabilidad, citopenia debido al fallo de la médula ósea, trombosis y raramente transformación leucémica. Al tener un paciente con estas características se decidió presentarlo.

The nocturnal paroxysmal hemoglobinuria, also known as Marchiafava-Micheli syndrome, is a clonal and acquired disease, caused by a somatic mutation of the PIG-A gene located in the X chromosome and modified a protein involved in the glicosilfosfatidilinositol synthesis that serves as anchorage for many proteins of the cell membrane; it is the only hemolytic anemia acquired by defect of the erythrocyte membrane. It is characterized by a chronic intravascular hemolytic anemia, hemoglobinuria, hyper coagulation, cytopenia due to the marrow failure, thrombosis and rarely leukemic transformation. Having a patient with these characteristics we decided to present the case.

Hemoglobinúria paroxística noturna: da fisiopatologia ao tratamento / Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: from physiopathology to treatment

Hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma anemia hemolítica crônica adquirida rara, de curso clínico extremamente variável. Apresenta-se frequentemente com infecções recorrentes, neutropenia e trombocitopenia, e surge em associação com outras doenças hematológicas, especialmente com síndromes de falência medular, como anemia aplásica e síndrome mielodisplásica. É considerada ainda um tipo de trombofilia adquirida, apresentando-se com tromboses venosas variadas, com especial predileção por trombose de veias hepáticas e intra-abdominais, sua maior causa de mortalidade. A tríade anemia hemolítica, pancitopenia e trombose faz da HPN uma síndrome clínica única, que deixou de ser encarada como simples anemia hemolítica adquirida para ser considerada um defeito mutacional clonal da célula-tronco hematopoética (CTH). A mutação ocorre no gene da fosfaditilinositolglicana classe-A, e resulta no bloqueio precoce da síntese de âncoras de glicosilfosfaditilinositol (GPI), responsáveis por manter aderidas à membrana plasmática dezenas de proteínas com funções específicas. A falência em sintetizar GPI madura gera redução de todas as proteínas de superfície normalmente ancoradas por ela. Dentre elas estão o CD55 e o CD59, que controlam a ativação da cascata do complemento. Assim, na HPN há aumento da susceptibilidade de eritrócitos ao complemento, gerando hemólise. Revisa-se aqui sua fisiopatologia, curso clínico, os tratamentos disponíveis com ênfase para o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênicas e para o eculizumab, um anticorpo monoclonal humanizado que bloqueia a ativação do complemento terminal no nível C5 e previne a formação do complexo de ataque à membrana, a primeira droga a demonstrar eficácia no tratamento da HPN.

Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a rare disorder, an acquired chronic hemolytic anemia, often associated with recurrent nocturnal exacerbations, recurrent infections, neutropenia, thrombocytopenia, and episodes of venous thrombosis. Its clinical course is highly variable. It frequently arises in association with bone marrow failure, particularly aplastic anemia and myelodysplastic syndrome. It is also an acquired thrombophilia, presenting with a variety of venous thrombosis, mainly manifested with intra-abdominal thrombosis, here the major cause of mortality. The triad of hemolytic anemia, pancytopenia, and thrombosis makes a truly unique clinical syndrome of PNH, which was reclassified from a purely acquired hemolytic anemia to a hematopoietic stem cell mutation defect of the phosphatidyl inositol glycanclass-A gene. This mutation results in an early block in the synthesis of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors, responsible for binding membrane functional proteins. Among these proteins are the complement inhibitors, especially CD55 and CD59, that play a key role in protecting blood cells from complement cascade attack. Therefore, in PNH occurs an increased susceptibility of red cells to complement, and consequently, hemolysis. We here review PNH physiopathology, clinical course, and treatment options, especially eculizumab, a humanized monoclonal antibody that blocks the activation of terminal complement at C5 and prevents formation of the terminal complement complex, the first effective drug therapy for PNH.